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VitD3对结肠癌作用影响研究
2020-04-23 17:25
论文题目:VitD3对结肠癌作用影响研究
首要说明:本论文内容与御用学术网无关,本平台只刊登提供学习,版权归作者所有,转载请注明。
论文来源:本文内容转载相关网站
论文作者:未知
作者单位:新疆医科大学
论文语种:中文
论文专业:临床医学
论文层次级别:博士毕业论文
论文字数:4万字
研究方向:癌症调控因子研究
论文用途:博士毕业论文答辩
论文数据处理要求:本论文通过研究国内外文献资料,采用实证分析,对数据进行SPSS统计学软件处理。
论文解决关键点:本博士论文根据结肠癌发病诱因进行相关医学生物分子学研究,从本源上认识结肠癌的发病机理是由于缺乏维生素D3导致未能有效抑制癌细胞增殖而进行的过度增长而发生,同时以此为据,在结肠癌手术治疗后进行维生素D辅助给药比较,确认维生素D对结肠癌治疗具有积极改善意义。
论文目前状态:论文通过答辩。
本文地址:
论文部分内容:
摘要:结肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,也是我国各种癌症发病最高及死亡率较高的恶性疾病之一,据我国卫生部最新资料统计数据显示,我国单患结肠肠癌死亡率在恶性肿瘤疾病中占据第5位,并且每年在恶性疾病发病中呈递增趋势。据现有的医学资料报告,结肠癌的诱因主要受患者长期生活不规律、偏嗜肉食类、及各种习惯不当引起,但究其于发病的根本原因,仍至今未有一个权威的结论阐述,更未有普及其发病本质的相关知识做法,这也给广大医学工作人员对其认识只停留于局限或者表面。因此在结肠癌的治疗中,未能更全面的深入的具有针对性的做出治疗,给患者带来一定的思想痛苦和经济负担。本文根据结肠癌发病的诱因,进行相关医学生物分子学研究,从本源上认识结肠癌的发病机理是由于缺乏维生素D3导致未能有效抑制癌细胞增殖而进行的过度增长。癌细胞是一种非良性健康细胞,它的生长依赖于体内的调控因子。维生素D3抗肿瘤作用机制是通过下调TGF-β信号通路来达到对癌细胞的增殖抑制、癌细胞的分化和癌细胞的凋亡的作用。Runx3蛋白是TGF-β信号转导通路下游的关键因子,Runx3蛋白的失活使得TGF-β信号通路发生紊乱,从而导致肿瘤的发生。研究表明,结肠癌组织中Runx3表达明显低于正常组织,恢复结肠癌细胞中 Runx3的活性,可以抑制肿瘤细胞的生长和转移。在结肠癌术后的辅助治疗中,应用维生素D3做为术后辅助治疗能改变患者临床的各项检查指标,并在预后干扰治疗中也显得尤为重要,维生素D3作为一种潜在的抗肿瘤药物,具有广阔的临床应用前景。因此,深刻理解维生素D3的抗肿瘤作用机制对临床的科学应用尤为重要。本博士论文将对维生素D3在结肠癌患病关系中进行探讨,并在术后结肠癌患者中的辅助治疗进行试验研究,为降低患者痛苦,减轻患者经济负担,延长患者预后生存期和提高患者生活质量提供更合理的临床医学帮助。
一、维生素D3调控RUNX3的作用于结肠癌的关系研究
(一)研究目的
探讨维生素D3作用于结肠癌细胞分化凋亡是否与上调Runx3的表达有关。
(二)研究方法
1、通过western blot方法检测结肠癌细胞系中Runx3的表达情况
2、通过维生素D3诱导Runx3对结肠癌细胞的表达作用
(三)研究结果
1、结肠癌细胞中Runx3的表达情况:采用western blot检测结肠癌细胞系Runx3基因表达结果显示:在SW480细胞系Runx3因子表达水平相对较高。
2、维生素D3通过诱导Runx3表达抑制结肠癌细胞的增殖:
细胞生长曲线结果显示,维生素 D3 作用于SW480-siRNA 细胞的生长速度显著快于对照组SW480-vector和SW480细胞,差异有统计学意义(p<0.05),而对对照组SW480-vector和SW480细胞的生长抑制作用无统计学差异。Runx3基因敲除后,维生素D3的抑制作用不明显,SW480-siRNA 加药前后生长速度无明显差异。
二、维生素D3对结肠癌术后的辅助治疗研究
(一)研究目的
分析维生素D3在结肠癌手术后的辅助治疗的作用及其意义
(二)研究方法
1、术前统计36例结肠癌患者特征,如年龄构成、饮食生活习惯等基本情况。
2、比较术后摄取维生素D3组与对照组的身体状况
(三)研究结果
1、比较36例患者结肠癌的年龄性别特征,无特异性差异(P>0.05),生活习惯和饮食习惯对结肠癌患者均有一定致病作用,其中对结肠癌危险因素饮酒、便秘、曾病史及红肉饮食具有显著增高(P<0.01;相对危险度(95%可信限)分别为3.33(1.85,7.42)、1.46(1.33, 5.18)、2.58(2.12, 8.86)、2.17(1.54, 6.35);膳食纤维及牛奶高钙类饮食是结肠癌保护因素(P<0.05),其相对危险度(95%可信限)分别为0.81 (0.38, 1.73)、0.37 (0.08, 0.24),比较饮食生活习惯对于结肠癌的发生起一定的作用,为结肠癌辅助治疗提供更具有临床价值信息。
2、通过比较维生素D3组和对照组,可以发现维生素D3组6周治疗后的肿瘤标志物变化差异较大(CEA 、CA19-9),分别为t=0.183,P<0.05和t=0.228,P<0.05;预后康复人数、康复时间及各项康复指标比较显著(P<0.05)。
三、结论
大量研究结果表明,维生素D3对结肠癌具有抑制作用,从基因学角度上实验,RUNX3因子在结肠癌甚至更多的其他癌病能找到其相关连的变化,维生素D3通过TGF-β信号通路调控,使得大量的RUNX3因子的激活达到癌细胞的抑制、分化和凋亡作用。据一项包含60个观察性研究的meta分析结果提示,维生素D3确证为结肠癌的保护因素。在本文实验研究中,也已证实大肠癌组的血清维生素D3浓度低于对照组人群的浓度,与多数文献报道结果一致。 另在本文的第二部分,对36例患者进行分组及术后维生素D3给药比较,发现其维生素D3组的预后康复较对照组效果好。因此探讨维生素D3辅助治疗结肠癌有助于临床治疗结肠癌的“局限性”,为更多的结肠癌治疗制定相关预防策略和措施具有重要意义。
关键词:维生素D3;RUNX3因子;结肠癌
Abstract:Colon cancer is one of the most common malignant tumors in human, it is one of themalignant diseases in China the highest incidence of various cancers and a high mortality, according to the latest China's Ministry of health statistics data show, therisk of colon cancer mortality only occupies fifth place in malignant diseases, and the annual presentation in the incidence of malignant diseases increased. According to the existing medical data report, cause colon cancer is mainly due to the long term of life of the patients with irregular, preference of carnivorous, and varioushabits caused by improper, but it is in the fundamental etiology, still has not been an authoritative conclusion to elaborate, no relevant knowledge to practice the popularity of disease essence, which also give medical staff knew only stay on thesurface of the limitations or. Therefore, in the treatment of colon cancer, not more comprehensive in-depth targeted treatment, bring some idea of suffering and economic burden to patients. According to the cause of colorectal cancer, related medical molecular biologyresearch, understanding the pathogenesis of colorectal cancer from the origin is theexcessive growth and due to the lack of Vitamin D3 fail to inhibit the proliferation of cancer cells. Cancer is a kind of non healthy cells, regulatory factor in its growth depends on the body. Vitamin D3 antitumor mechanism of apoptosis by down regulating the expression of TGF- β signaling pathway to cancer cell proliferation, cell differentiation and cell function Runx3 protein is a key factor of TGF- beta signaling pathways downstream of TGF-beta signaling pathway, live the disturbances of the loss of Runx3 protein, thusresulting in tumorigenesis. Research shows that, obviously lower than the normal tissue Runx3 expression in colon cancer, colon carcinoma cells Runx3 in the recovery of activity, can inhibit the growth and metastasis of tumor cells. In the adjuvant therapy after resection of colorectal cancer, the application Vitamin D3 as postoperative adjuvant therapy and the check index can change patients, and in the prognosis of interference treatment is also very important, Vitamin D3 as apotential antitumor drug, has a wide prospect of clinical application. Therefore, understanding the anti-tumor mechanism Vitamin D3 are especially important to scientific and clinical application. This paper will discuss Vitamin D3 in colon cancer relationship, and test results in adjuvant treatment of patients with colorectal cancer in postoperative, in order to reduce the pain of patients, reduce the economic burden of patients, prolong the survival time of patients and improve the life quality of the patients with clinical medicine more reasonable help.
One,Study on the relationship between a Vitamin D3 regulation, the role of RUNX3 incolon cancer
(a)The purpose of the studyTo investigate the Vitamin D3 effect on colon cancer cell differentiation and apoptosisis associated with the up regulation of Runx3 expression.
(b) research methods
1, the expression of Western blot for the detection of colon cancer cell line Runx3
2, the role of Vitamin D3 induced Runx3 expression in colon carcinoma cells
(c) the results
1, node Runx3 expression in colon cancer cells by Western blot: results showed that Runx3 gene expression in colorectal cancer cell lines: relatively higher expression levels in the Runx3 factor in SW480 cell line.
2, Vitamin D3 inhibits the proliferation of colon cancer cells induced by Runx3:
The cell growth curve showed that, the growth rate Vitamin D3 effect on SW480-siRNA cells significantly faster than the control group in SW480-vector and SW480 cells, the difference was statistically significant (p<0.05), while the control group SW480-vector and SW480 cell growth inhibition was no statistics difference. The Runx3 gene knockout, Vitamin D3 inhibitory effect is not obvious, the SW480-siRNAgrowth rate had no significant difference before and after dosing.
Two, Vitamin D3 on study of adjuvant therapy after resection of colorectal cancer
(a) the purpose of the studyAnalysis Vitamin D3 in adjuvant treatment of colorectal cancer after operation effect and its significance.
(b) research methods
1, the preoperative data of 36 cases of patients with cancer node characteristics,basic information such as age, diet habits.Health uptake Vitamin D3 group and 2 of control group, to compare the postoperative.
(c) the results
The age and gender characteristics of 1, compared with 36 cases of patients with colon cancer, no specific difference (P>0.05), living habits and eating habits ofpatients with colon cancer have a certain pathogenic role, including drinking, on colon cancer risk factors of constipation, have history and eating red meat hasincreased significantly (P<0.01); relative risk were 3.33 (1.85,7.42), 1.46 (1.33, 5.18), 2.58 (2.12, 8.86), 2.17 (1.54, 6.35); dietary fiber andhigh calcium milk diet is colon cancer protective factor (P<0.05), the relative risk(95% confidence limits) were 0.81 (0.38, 1.73), 0.37 (0.08, 0.24), compared to eating habits to play a role in colon cancer, provide more information for clinical value ofadjuvant therapy of colon cancer.
2, by comparing the Vitamin D3 group and control group, can be found Vitamin D3group 6 weeks after the treatment of tumor markers (CEA, CA19-9 difference is big),respectively t=0.183, P<0.05 and t=0.228, P<0.05; prognosis number of rehabilitation, recovery time and the recovery index significantly (P<0.05).
Three, the conclusion
The results show that a large number, Vitamin D3 has inhibitory effect on colon cancer, experiment from the genetics angle, variation of RUNX3 factor in colon cancer and other cancer more can be found in the related, Vitamin D3 through regulation of TGF- beta signaling pathway, the bulk RUNX3 factor activation tocancer cells, differentiation and apoptosis inhibition. According to a 60 meta analysis of observational results suggest, Vitamin D3 were protective factors of colon cancer.In the experimental study of this paper, has also confirmed that serum concentration of Vitamin D3 colorectal cancer group was lower than control group, the resultsreported with most literature. In the second part of this paper, 36 cases of patients were grouped and postoperative Vitamin D3 administered rehabilitation prognosis,found the Vitamin D3 group compared with the control group effect. So the discussion Vitamin D3 adjuvant therapy of colon cancer is helpful to clinical treatment of colon cancer "limitation", is of great significance to formulate relevant strategies and measures for the prevention of colon cancer more treatment.
Keywords: Vitamin D3; RUNX3 factor; colorectal cancer
结肠癌的发病进程是由正常黏膜上皮转变成腺瘤再发展成腺癌,发病原因大多受环境因素、饮食因素、生活习惯和遗传因素等综合作用所引起。据流行病学研究从结肠癌低发区移民到高发区后患病率明显升高;饮食习惯常食红肉患病率较高,白肉次之,蔬菜更少。研究显示,约85%-90%结肠癌患者都与饮食因素相关。由于饮食因素属于可以有效干预的因素之一,该领域研究成果对于结肠癌一级预防具有重要临床意义。
维生素 D3 是人体必须的一种微量有机元素,成人每日需要摄入维生素D3 5.0 ug (200 IU)。维生素 D3 被血浆中的维生素 D 结合蛋白(Vitamin D-binding protein)运送至肝脏,在肝内被25-羟基化酶(25-OHase)作用后形成25-羟基维生素 D3(25 OH-D3),后者与α-球蛋白结合并转移至肾脏后被线粒体中的细胞色素 P450羟基化后形成有生物活性的1,25(OH)2D3。维生素 D3 除了调控血磷和钙水平外,还具有抑制细胞增殖、诱导细胞分化和凋亡,调节原癌基因表达等功能。据相关研究调查,血清中含维生素 D3较高的群体患结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性疾病比血清中含维生素D3的群体较低。如在结肠癌患者研究中结果显示,血清中 25(OH)-VD3 的浓度高低与患者的生存期限呈反比关系,并且同样在乳腺癌、前列腺癌及其他肿瘤中25(OH)-VD3 也有此作用。因此维生素D3对于结肠癌等各种恶性疾病都有一定的关联作用。而对于维生素D3作用于结肠癌的作用机制,也在相关的医学资料文献中看到,主要通过TGF-β通路受调RUNX3因子达到抑癌表达作用。
Runx3 是人类 Runt 结构域转录因子家族成员,分别为Runx1、Runx2 和 Runx3。Runt 家族成员在细胞正常发育和肿瘤发生过程中扮演了重要角色。Runxl 调节胚胎的肝脏造血和血液细胞系的分化;Runx2 是重要的骨生成调节因子,其突变与人类的锁骨和颅骨发育不良有关;Runx3 被认为是Runx基因家族中最原始、研究最不明确的,在胃黏膜上皮细胞生长及分化调控、脊神经节的神经发育和 B 细胞 IgA 亚类的转换以及 T 细胞分化等方面发挥重要作用。最近的研究显示 Runx3 是一种抑癌基因,参与了乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等的发生发展,在多种肿瘤中的作用备受瞩目。因此,深刻理解Runx蛋白对多种组织肿瘤的作用将对临床应用具有重要的理论意义和实际意义。
由于Runx3与维生素D3的关联作用,Runx3的抑癌作用使维生素D3作为一种潜在的抗肿瘤药物在肿瘤治疗方面具有较广阔的前景。但目前尚不明确维生素D3的具体作用靶点,以及维生素D3能否在其他类型肿瘤细胞中也具有Runx3的诱导表达作用。如果在以后更多的临床试验中证实维生素D3确有此作用,将为Runx3缺失相关肿瘤提供一种全新的预防或者辅助治疗手段。在本研究中,我们通过实验来验证在结肠癌细胞中维生素D3对Runx3基因表达的调控作用及其治疗试验进行探讨分析。
第一部分 RUNX3因子调控与结肠癌关系
据相关医学文献资料报道,维生素D3的抗肿瘤作用机制与下调TGF-β信号通路密切相关。而TGF-β通路下游的一个重要转录调节因子RUNT相关转录因子RUNX3是一种新型抑癌基因,在胃癌、食道癌、结肠癌等均显示存在RUNX3不同程度的转录失活或表达下调。RUNX3蛋白的失活使得TGF-β信号通路发生紊乱,从而诱导肿瘤发生。然而,尚无报道维生素D3的抗结肠癌细胞的增殖作用与RUNX3基因的表达是否相关。在本研究中,我们通过检测维生素D3作用后结肠癌细胞中RUNX3基因的表达,以及敲除结肠癌细胞中RUNX3基因后检测维生素D3对其生长能力的影响,初步探讨维生素D3抑制结肠癌细胞增殖的作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料 
人结肠癌细胞系SW480为北京大学医学部第三医院实验室冻存;小牛血清购于上海基免生物科技有限公司;RP-MI1640、G418购于GIBCO公司;兔抗人RUNX3多克隆抗体、小鼠抗人β-actin单克隆抗体购于Santa Cruz公司;HRP标记的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、T4连接酶、各种内切酶购于TaKaRa公司;RNA抽提试剂盒和脂质体转染试剂lipo-fectamine 2000购于Invitrogen公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和药物处理
取人结肠癌细胞SW480适量置于100mL/L小牛血清的RP-MI1640培养液中,按照相关文献参考对其SW480进行培养,培养后作为实验组,另用无水乙醇作为对照组。维生素D3用无水乙醇溶解,用培养液稀释浓度分别为10-10、10-9、10-8、10-7mol/L。
1.2.2 RT-PCR检测RUNX3 mRNA表达 
将上述细胞培养72h后,用RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA并定量。扩增引物:RUNX3α:5’-CAGTGGGCGAGGGAAGAGT-3’和5’-CGGGAGGTAGGTATGGTAA-3’;产物大小499BP。β:5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3’和5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’;产物大小540BP。PCR反应条件:94℃变性5min,一个循环,94℃变性45s,56℃退火45s,72℃延伸45s,进行32个循环,再以72℃延伸5min即可获得。用已获知的RUNX3基因序列设计其SiRNA的序列并合成双链DNA,退火连接,转化大肠杆菌,挑选克隆扩增,质粒提取,酶切及PCR鉴定,得到重组质粒RUNX3-siRNA
1.2.3 Westernblot检测RUNX3蛋白表达
提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度,各组取(60~100)μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳进行染色标记。取50g/L脱脂奶粉稀释一抗(1∶200兔抗人RUNX3多克隆抗体、1∶4000小鼠抗人β-actin单克隆抗体;取50g/L脱脂奶粉稀释相应二抗(1∶2 000山羊抗兔IgG及1∶2 000山羊抗小鼠IgG),分别都用室温孵育1~2h,TBST摇洗3次,10~15min/次,ECL显色。
1.2.4 细胞转染SW480细胞常规培养,将处于对数生长期的细胞重新接种于6孔板中进行转染。无血清培养液洗涤细胞。对于每孔待转染细胞,将0.8~1.0μg(6μL)的相应质粒稀释于100μL无血清培养液,空载体为对照。将6μL Lipofectamine2000稀释于100μL无血清培养液。室温静置5min。Lipofectamine2000与相应质粒混合,室温静置30min。将200μL的以上混合物加入板中,再加入0.8mL无血清培养液。培养6h后,补充1mL200mL/L小牛血清的RP-MI1640培养液,继续培养。24h后加入G418筛选阳性细胞(G418筛选浓度为400mg/L),扩增培养。阳性克隆株分别命名为SW480-siRNA细胞和SW480-vector。
2 结果
2.1 维生素D3诱导SW480细胞RUNX3基因表达的剂量依赖性增加 
RT-PCR试验:细胞中RUNX3 mRNA的表达随着维生素D3量的增加而逐渐增加,且具有明显的剂量依赖关系;Westernblot试验:细胞中RUNX3在蛋白表达水平也呈剂量依赖性增加,与RT-PCR结果一致。
2.2 维生素D3通过诱导RUNX3表达抑制结肠癌细胞增殖细胞生长曲线
维生素D3作用后SW480-si RNA细胞的生长速度显著快于对照组SW480-vector和SW480,差异有统计学意义(P<0.05),而对照组SW480-vector和SW480的生长抑制作用差异不明显(P>0.05),SW480-vector和SW480之间的生长速度差异较小。基因敲除后,维生素D3的抑制作用不明显,SW480-siRNA加药前后生长速度无明显差异。
3讨论
3.1近年来,研究维生素D3的抗肿瘤作用一直处于缓行期,对于维生素D3的作用于肿瘤细胞的机制是其研究的重要课题,但鲜有足够的临床试验证明维生素D3在减少结肠癌的发病率和死亡率发挥重要作用。而现有的医学临床资料中,主流观点认为维生素D3是通过下调TGF-β信号通路来调控Runx3因子对癌细胞的抑制生长和诱导凋亡起抗肿瘤作用。
3.2 TGF-β是TGF-β信号通路的超家族成员之一,它是许多关键性生物学行为的信号转导分子,除此之外,还有 Activin和骨成型蛋白(BMP)等TGF-β家族成员。TGF-β参与的生物学行为转导的作用是对多种突变细胞的生长抑制、分化。TGF-β产生信号转导的途径是受TGF-β激活因子激活后TGF-β活体能够快速的与其含有丝氨酸或苏氨酸激酶活性的TGF-β受体I和II相结合,产生异四聚体复合物而触发细胞内信号通路。其中Smads家族蛋白Smads将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用TGF-β作为配体形成的受体复合物,激活Smads进入核内,共同激活或抑制它们调节的靶基因的转录。TGF-β在TGF-β-Smads信号通路中任何一个环节的变化,都会导致信号转导通路的异常。
3.3 Runx3是RUNT结构域转录因子家族成员之一,位于人染色体1p36.1内,基因全长约67bp,含有两个启动子,分别为P1和P2。两个启动子区域均含数个分离的转录起始点,其中Runx3 mRNA主要来自于P2启动子的转录。许多的肿瘤组织在人染色体1p36.1座位处都会有表达异常的情况出现。像常见的胃癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌等都会发生这样的情况。同时Runx3也是Runx家族中基因最短的分子,并且在各个物种之间Runx3基因序列同源性很高,因此它被认为是Runx3家族进化中的初始分子。Runx3是Runx转录因子家族研究最少,功能最不明确的分子。目前Runx3参与多种肿瘤的发生和进展中的作用备受关注。Runx3参与抑癌机制与其调控相关因子的表达具有密切相关,据目前的主流权威医学报道,Runx3通过TGF-β通路来调控癌细胞的分化和凋亡作用。Runx3是TGF-β信号通路下游的一个转录因子,Runx3蛋白与相应的DNA受体相结合,在TGF-β-BMP信号传导中起着重要作用。Runx3蛋白在靶基因启动子区可作用于众多转录因子,增强或主动抑制靶基因的转录激活,当Runx基因表达受抑制时,影响TGF-β信号通路的转导,从而诱导肿瘤的发生。所以,Runx3转录因子与TGF-β超家族成员共同介导一些重要的生物学效应。
3.4 维生素D3可增强结肠癌细胞对TGF-β1的敏感性,二者联合应用对结肠癌细胞的生长抑制作用具有协同效应。本文研究结果显示,维生素D3的抗肿瘤增殖作用与RUNX3基因的表达量上调有关。作用结肠癌细胞中RUNX3后的表达变化经维生素D3作用后,结肠癌细胞中RUNX3基因的表达呈明显的剂量依赖性增加。关于Runx3与维生素D3的关联研究,早在1999年Le等用维甲酸处理HL-60白血病细胞时发现全反式维甲酸可以诱导HL-60细胞表达Runx3,而且这种诱导表达作用可以被维生素D3增强。由此可见,维生素D3对Runx家族Runx3转录因子具有调控作用。
3.5 在结肠癌患者群体中,维生素D3受体VDR基因FokI因子受地域和人种分布不同而不同,具有地域和(或)人种特点。在一项实验数据结果中,VDR基因FokI与结肠癌人群分布呈动态正性相关。FokI是一种存在于细菌Flavobacterium okeanokoites的type IIS限制酶,其分子量为65.4 kDA,为587个氨基酸组成。分为N端的DNA结合区块(N-terminal DNA-binding domain)和C端的DNA切割区块。FokI位点等位基因F是其影响的重要靶位点。但具体机制在本文未能对此作出明确的证实和详细的阐述。
3.6 由于维生素D3和钙是协调补益作用,维生素D3参与人体的另外一个抑癌作用机制,也同样在钙产生相似的作用。据现有的文献资料证实,维生素D3协同钙增强体内相应因子活性,调节PKC活性,稳定细胞膜,减少K-ras突变的作用直接抑制结直肠上皮细胞增殖。使肠上皮细胞凋亡增加3.4倍,直接诱导细胞增殖分化凋亡以及血管形成和调控细胞周期来阻止结肠癌的发展进程。
上述研究表明Runx3与人类结直肠癌的发生发展有密切相关,且与肿瘤的分化程度和转移相关。因此,维生素D3作用于Runx3可能为结肠癌的临床诊治甚至预后评估提供一个非常有价值的参考指标。这为我们下一步研究提供了一个全新临床治疗试验思路。
第二部分  维生素D3参与结肠癌术后作用实验
结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,在胃肠道肿瘤恶性疾病中占据第二位,排在其他恶性肿瘤中第五位,好发于直肠及直肠与乙状结肠交界处,约占其他病变部位60%。发病年龄多在40岁以后,发病男女性别比为2:1。发病原因主要受环境污染、常年食用高蛋白、高脂肪、低膳食纤维食品等所致;小部分因其他肿瘤转移形成。结肠癌分子医学病因已在第一部分实验证实,由维生素D3水平减少导致TGF-β信号通路紊乱,使得作用于RUNX3因子表达失调,癌细胞未能抑制增殖产生。对于维生素D3真正作用于癌细胞的效果,临床还没有更多的相关文献资料参考。本文依据第一部分的实验基础,在结肠癌术后给予维生素D3药物补充辅导治疗,进行对比维生素D3临床治疗疗效,为临床使用维生素D3辅导结肠癌术后提供更多的医学实验论证。
1研究对象
本研究对象来源于作者所在的医院住院部患者,挑选为已确诊结肠癌并预手术的患者。挑选人数36人,在挑选过程中切忌其他因素带来对试验的干扰。挑选试验期为2013年1月至2013年12月。
1.1 临床诊断:年龄40岁以上,早期出现排便习惯与粪便性状改变,表现为绞痛、腹泻、便秘交替或黏液血便。伴有定位不确切性持续性隐痛,扪及腹部有肿块。消瘦、乏力、低热等症状。晚期出现肠梗阻。含有①I级亲属结直肠癌史者;②有癌症史或肠道绒毛状腺瘤或息肉病史者;③大便潜血阳性者;④有以下两项以上者:黏液血便、慢性腹泻、慢性便秘、慢性阑尾炎史、精神创伤史、接收过盆腔放疗病史者为高危人群,根据临床表现,应做如下检查:1)粪便潜血试验:可作为普查筛检或早期诊断的线索;2)X线气钡灌肠对比造影:可发现充盈缺损、肠腔狭窄、粘膜皱襞破坏等征象,显示癌肿部位和范围;3)纤维结肠镜:具确诊价值,超声内镜还可判断肿瘤浸润深度及周围淋巴结转移情况,助于术前肿瘤分期;)超声、CT、MRI检查,有助于发现转移灶和肿瘤周围浸润情况;4)血清癌胚抗原(CEA),60%结肠癌患者高于正常,主要用于手术效果的判断及术后复发的监测。
1.2 手术指征:①已确诊结肠癌的患者;②结肠癌患者在保守治疗下效果不佳者;③血常规、大小便常规及各项生化体检达到手术阈值水平者;④对患者术后体质康复及预后生存质量做出综合性评估,确定手术利大于弊;⑤无伴有其他疾病者,如心、肺、肝、肾等器官功能不全者;⑥结肠癌分期不同,手术方法及手术预期也不相同。
2 研究方法
选取2013年1月1日至2013年12月31日所在作者单位的36例住院结肠癌患者,年龄42-65岁,平均年龄54±0.47岁,男性28人,女性8人。其中盲肠癌3人,升结肠癌1人,降结肠癌8人,乙状结肠癌24人,分析其年龄和性别无统计学差异(分别见表1和表2),可纳入其实验对象。
表1   两组患者的年龄比较
组别 例数(n) 年龄 t P
实验组 15 53.5±7.58 0.971 >0.05
对照组 21 56.2±8.62
注:求上表格中的自由度ν=n1+n2-2=15+21-2=34,查t界值表,ν=34自由度的t值0.971位于双侧P值0.2-0.4之间,故 P>0.05,无统计学差异,具有可比性。
表2   两组患者的性别比较
组别 合计(n) χ2 P
实验组 10(66.67%) 5(33.33%) 15 0.952 >0.05
对照组 17(80.95%) 4(19.05%) 21
合计(n) 27 9 36
注:由理论频数得到的四表格数据为:11.25;3.75;15.75;5.25分别代入卡方基本公式为χ2=Σ(A-T)2/T=0.952,确定自由度ν=1,查卡方界值表得χ20.05(1)=3.84,故χ2=0.952<3.84,所以P>0.05,无统计学差异,具有可比性。
2.1 Meta统计
对确诊结肠癌患者手术前采用随机性的问卷调查,问答内容为饮食种类(偏向蔬菜、白肉、红肉哪类)、生活习惯(喝酒、吸烟、日常大便次数)、曾病史(是否曾患有慢性胃肠道疾病等如炎症或息肉)及居住环境调查(农村和城镇),了解患者的患病相关因素,为研究对象提供更具有合理的临床治疗价值(见表3)。
2.2手术方法
手术准备:①术前进行全面检查,对患者身体状况进行综合全面评估;②术前做好肠道空虚清洁,尽量减少肠腔内细菌数量,防止术后感染;③积极纠正电解质紊乱、贫血症等症,改善患者身体状况;④常规手术准备时间为三天,口服无渣流质饮食,可术前12-24小时服用复方聚乙二醇电解质散2000毫升-3000毫升等泻剂清空肠道,术前一天服用甲硝唑0.4g,一日三次。
手术方法:患者仰卧手术床,术前行手术全麻并全程呼吸机、心电图等设备监控。术者站立于方便手术的同侧或对侧位。建立人工气腹压力位10mmHg,根据肿瘤位置确定操作孔,在腹腔镜下用细丝带结扎肿瘤两端肠管,用单极电凝剪开结肠侧腹膜,寻找输尿管,在输尿管周围组织用双极电凝止血。切除游离的结肠,利用腔内打结的方法分别于结肠血管根部结扎血管,用单极电凝剪除相应区域内的淋巴脂肪组织,切除范围除癌肿所在肠袢外,还应包括其肠系膜和区域淋巴结:1)右半结肠切除术适用于盲肠、升结肠及结肠肝曲部的癌肿。切除范围:回肠末端15~20公分、盲肠、升结肠及横结肠的右半,连同所属系膜及淋巴结。肝曲的癌肿尚需切除横结肠大部及胃网膜右动脉组的淋巴结。切除后作回、结肠端端吻合或端侧吻合(缝闭结肠断端)。2)左半结肠切除术:适用于降结肠、结肠脾曲部癌肿。切除范围:横结肠左半、降结肠、部分或全部乙状结肠,连同所属系膜及淋巴结。切除后结肠与结肠或结肠与直肠端端吻合。3)横结肠切除术:适用于横结肠癌肿。切除范围:横结肠及其肝曲、脾曲。切除后作升、降结肠端端吻合。若吻合张力过大,可加做右半结肠切除,作回、结肠吻合。4)乙状结肠癌肿的根治切除:根据癌肿的具体部位,除切除乙状结肠外,或做降结肠切除或部分直肠切除。作结肠结肠或结肠直肠吻合。行完手术,断端手工缝合还纳入腹腔,重新建立气腹,缝合关闭系膜,用无菌蒸馏水洗净腹腔并吸净缝合关闭。
注意事项:①开腹后探查肿瘤时宜轻,勿挤压;②切除时首先阻断肿瘤系膜根部血管,防止挤压血行转移,并由系膜根向肠管游离;③在拟切断肠管处用布带阻断肠管,减少癌细胞肠管内种植转移。在阻断肠管内注入抗癌药物,常用5-氟脲嘧啶30毫克/每公斤体重,加生理盐水50毫升稀释,保留30分钟后分离肠管;④与周围组织粘连时能切除时尽量一并切除;⑤关腹前要充分的冲洗腹腔,减少癌细胞种植与腹腔感染。
2.3 试验方法
各期结肠癌患者行根治性手术,对手术伤口愈合、感染、疼痛情况进行统计,以排除手术带来的预后康复干扰。对手术后36例患者采用随机分组,一组21人为对照组,一组15人为实验组。对照组组采用术后奥沙利铂、氟尿嘧啶、四氢叶酸钙三联常规辅导治疗,实验组采用奥沙利铂、氟尿嘧啶、四氢叶酸钙和维生素D3辅导联合治疗,辅助治疗周期为6周,治疗后观察患者血清CEA和CA19-9肿瘤标志物含量,观察两组康复人数、康复时间及康复各项外观指标。
3 统计方法 采用SPSS12.0软件进行统计学分析。P>0.05为无统计学意义,P<0.05为具有统计学差异,P<0.01为显著差异。
4 结果
①对36例结肠癌患者进行饮食、生活习惯等基本情况调查,调查后得到样本资料,并对其样本资料进行meta统计分析,结果显示:单因素中的饮酒、大便异常、曾病史、和常食红肉在结肠癌患病中具有显著特征性(P<0.01),为结肠癌危险因素,而经常锻炼、常食蔬菜、红肉和含钙类高的为结肠癌保护因素(P<0.05);多因素分析结果也表明,含钙和维生素D3类食物(如牛奶)、蔬菜类食物其相对危险度(95%可信限)分别为0.37 (0.08, 0.24)、0.81 (0.38, 1.73),饮酒、曾病史(如肠息肉、慢性肠炎等疾病)、红肉(包括猪肉、牛肉、羊肉等)其相对危险度(95%可信限)分别为3.33(1.85,7.42)、2.58(2.12, 8.86)、2.17(1.54, 6.35)(见表3)。
表3   结肠癌与多方位相关因素分析结果
.变量          实验组(15例)   对照组(21例)     P值        OR值*  
分类变量
性别                                                           >0.05
男性           10(66.67%)      17(80.95%)                    ——
女性           5(33.33%)       4(19.05%)                       ——
吸烟                                                          >0.05
否            4(26.67%)        6(28.57%)                         ——
是            11(73.33%)       15(71.43%)                      ——
饮酒                                                          <0.01
 否            3(20%)         5(23.81%)                          1(reference)
 是            12(80%)        16(76.19%)                       3.33(1.85,7.42)
高钙维生素D3食物(牛奶)                       <0.05
 偶尔          13(86.67%)       20(95.24%)                 1(reference)
 经常          2(13.33%)         1(4.76%)                     0.37(0.08, 0.24)
蔬菜                                                            <0.05
 偶尔          4(26.67%)         6(28.57%)                   1(reference)
 经常          11(73.33%)        15(71.43%)                 0.81(0.38, 1.73)
白肉                                                            >0.05
 偶尔          8(53.33%)         8(38.1%)                      ——
 经常          7(46.67%)        13(61.9%)                     ——
红肉                                                           <0.01
 偶尔          2(13.33%)         2(9.52%)                    1(reference)
 经常          13(86.67%)        19(90.48%)                2.17(1.54, 6.35)
大便                                                           <0.01
 异常          13(86.67%)        19(90.48%)               1(reference)
 正常          2(13.33%)         2(9.52%)                    1.46(1.33, 5.18)
锻炼                                                           <0.05
 偶尔          12(80%)           19(90.48%)                 1(reference)
 经常          3(20%)            2(9.52%)                      0.56(0.46, 1.23)
曾病史                                                      <0.01
 有            15(100%)        20(95.24%)                  1(reference)
 无            0(0)                 1(4.76%)                    2.58(2.12, 8.86)
环境                                                          <0.05
 城市          3(20%)            6(28.57%)                     ——
 农村          12(80%)         15(71.43%)                     ——
*注:OR值为95%可信区间值。
②归类结肠癌临床分期,对36例结肠癌患病类型进行医学统计分析,实验组和对照组发病率分别为Dukes A期(I期)26.67%、28.5%;Dukes B期(II期)40%、42.85%;Dukes C期(III期)33.33%、28.57%。统计结果比较无差异性(P>0.05),可剔除两组因患病期型所带来的差异性(见表4)。
表4   两组结肠癌分期类型统计比较
组别 患者例数(n) Dukes A期(n) Dukes B期(n) Dukes C期(n) DukesD期(n)
实验组 15 4(26.67%) 6(40%) 5(33.33%) 0
对照组 21 6(28.57%) 9(42.85%) 6(28.57%) 0
③两组术后辅助治疗6周后进行对其血清癌胚抗原(CEA) ELISA法检测,检测结果实验组血清值(为18.5±0.35μg/L,明显低于对照组值(P<0.05)(见表5)。说明实验组给予维生素D3治疗后,身体恢复状况较对照组好。
表5    两组治疗后的血清CEA水平含量比较
组别 例数(n) 血清CEA水平(ELISA法) t P
实验组 15 18.5±0.35μg/L 0.183 <0.05
对照组 21 32.2±0.82μg/L
注:t检验和P值率按上述方法计算,同理获得。
④术后辅助治疗6周后进行对两组患者血清糖链抗原19-9检测,ELISA法检测结果显示实验组血清值值为36.3±0.87 kU/L,明显优于对照组(P<0.05)(见表6)。说明实验组给予维生素D3治疗后,身体恢复状况较对照组好。
表6    两组治疗后的血清CA19-9水平含量比较
组别 例数(n) 血清CA19-9水平(ELISA法) t P
实验组 15 36.3±0.87 kU/L 0.228 <0.05
对照组 21 44.5±1.16 kU/L
注:t检验和P值率按上述方法计算,同理获得。
⑤两组术后辅助治疗6周过程中并对其患者进行走访复查,统计结果显示实验组完全康复为53.33%,高于对照组的完全康复33.33%。具有明显的统计学差异(P<0.05)(见表7)。说明实验组给予维生素D3治疗后,康复情况较对照组好。
表7    两组患者辅助治疗后的康复人数
组别 完全康复(n) 不完全康复(n) 合计(n) χ2 P
实验组 8(53.33%) 7(46.67%) 15 0.289 <0.05
对照组 7(33.33%) 14(66.67%) 21
合计(n) 13 23 36
注:χ2检验和P值率按上述方法计算,同理获得。
⑥实验组与对照组患者在术后辅助治疗康复过程中,实验组患者三个月内康复率为87.5%,对照组为57.14%,统计分析具有明显差异(P<0.05)(见表8)。说明给予维生素D3治疗的实验组优于对照组,康复周期较短。
表8    两组患者术后辅助治疗康复周期
组别 三个月内康复
(n)
半年内康复
(n)
合计(n) χ2 P
实验组 7(87.5%) 1(12.5%) 8 0.218 <0.05
对照组 4(57.14 %) 3(42.86%) 7
合计(n) 11 4 15
注:χ2检验和P值率按上述方法计算,同理获得。
⑦在两组辅助治疗6周的过程中,实验组的身体状况康复指标如饮食与大便变量状况未有明显差异(P>0.05),活动、气色和睡眠变量较对照组好,平均高于10%-15%率值,而且也存在统计学差异(P<0.05),(见表9)。说明给予维生素D3治疗的实验组优于对照组,各个康复指数明显得到较快的改善。
表9    比较术后摄取维生素D3组与对照组的身体状况康复指数
变量    实验组(15例)   对照组(21例)   χ2值     P值
饮食
正常     14(93.33%)      17 (80.95%)
差      1(6.67%)            4(19.05%)       0.546     >0.05
活动
正常    14 (93.33%)       15(71.43%)
不能    1(6.67%)             6(28.57)       0.277    <0.05
气色
较好    13(86.67%)        16(76.19%)
较次     2 (13.33%)         5(23.81%)     0.314    <0.05
睡眠
较好     13(86.67%)       14(66.67%) 
欠佳     2 (13.33%)        7(33.33%)      0.248    <0.05
大便
正常     14 (93.33%)      19(90.48%)
异常     1 (6.67%)           2(9.52%)      0.695      >0.05
注:χ2检验和P值率按上述方法计算,同理获得。
5 讨论
结肠癌是指结肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变,全球每年新发病例约800万人,占所有恶性肿瘤的10%~15%。据世界卫生组织报道,发展中国家的结直肠癌的发病率迅速升高,并且死亡率已远远超过所有癌症死亡率的7.2%。不同国家和地区的结直肠癌发生的差异除了遗传因素外,很大程度上由环境因素差异造成的,例如膳食因素。来自临床和流行病学和基础研究的资料显示增加钙、维生素D和奶制品可有效预防结肠癌的发生,并以作为化学预防剂进入临床试验。此外还发现钙和维生素D3具有协同作用。
在治疗结直肠癌方面,目前最主要的方法是手术治疗,根据其大小、部位、活动度、分化程度等指标选择不同的手术方式。此外,使用化疗、放疗、免疫治疗、导向治疗、基因治疗、中西医结合等辅助方式进行治疗。在结直肠癌患者中,癌变细胞的浸润以及扩散是此病对人体产生危害的关键,也是造成较高死亡率的根本因素。随着人类科技水平的不断发展,大量的化学物理致癌因素开始产生,导致癌症的患得率呈上升趋势,当然与人的饮食息息相关的结直肠癌也不例外。具相关统计,结直肠癌的发病率的增长趋势在全世界位据前列。当前临床对结结直肠癌的治疗仅仅只局限于肿瘤切除术,相关研究表明:常规来说,进行手术治疗后的患者五年内生存几率达百分之五十左右,如若是癌变早期,癌变部位只局限于粘膜部位还没有发生广泛性扩散时,生存率能够在百分之九十左右;如若已到晚期发生了淋巴变性转移,则存活率要低于百分之三十。
5.1 结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,排在消化道恶性肿瘤第三位。受现代生活水平增高影响,其发病率正在以每年4.2%的速度逐年递增。其发病原因为①环境污染:水中致癌化学物质,种植农作物使用大量的农药;②长饮食不当:常年食用高蛋白、高脂肪类食品产生大量甲基胆蒽诱发结肠癌,低纤维食物含戊糖量少,减缓排便速度,使肠道吸收有害物质及活性致癌。③家族性疾病:如家族性腺瘤息肉、溃疡性结肠炎等慢性炎症使肠黏膜反复破坏和修复可诱癌发生;④遗传性疾病:遗传性结肠癌为其发病的10%-15%的比率。⑤其他癌症转移所致:如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等可转移诱发结肠癌。此外结肠癌的发病还与精神因素、年龄、内分泌因素、环境应激能力、气候因素、免疫功能失常及病毒感染等有密切关系,但尚需在一定条件下才能发生。在结肠癌的发病早期,并无明显症状,但随着癌肿的不断增大,症状表现也随之而来,主要表现为便血、腹泻、便秘等排便习惯改变,以及食欲不振、体重减轻、贫血等晚期结直肠癌症状,尚有排便次数增多,排便不尽、便意频繁、里急后重等癌肿局部刺激症状。性别方面,结直肠癌的发病以男性为主,男女的发病率比例约为2:1。发病年龄常为40-65岁,对于结肠癌发病机制,目前尚未完全明确,但主流观点认为发病的本质是患者缺乏维生素D3,导致TGF-β信号通路减弱,Runx3表达基因紊乱所为,使作用于癌细胞增殖不被抑制和诱导分化引起。
5.2由于早期结肠癌临床症状不具有特征性,常要检测血清癌胚抗原及纤维结肠镜才能确诊,患者往往对其初期不适症状不能产生主动意识,因此大多不能早期发现。据相关医学资料统计,80%结直肠癌患者在发现时已到晚期,早期诊断率仅为10%-15%。根据结肠癌在临床上的进展,可分为①Ⅰ期(Dukes A期):癌症局限于肠壁内,无淋巴转移。1)A0期:癌局限于粘膜、2)A1期:癌局限于粘膜下层、3)A2期:癌侵及肠壁肌层未穿透浆膜;②Ⅱ期(Dukes B期):癌肿侵犯浆膜层,或浆膜外组织,但尚能整块切除,无淋巴转移;③Ⅲ期(Dukes C期):癌肿侵犯肠壁全层或未完全侵犯全层,并伴有淋巴腺转移1)C1期:近处淋巴转移(肠旁),2)C2期:远处淋巴转移(系膜);④Ⅳ期(Dukes D期):已有远脏转移,局部广泛侵润或淋巴结广泛转移不能根治切除。其中Ⅲ期和Ⅳ期较为严重,侵入小血管及淋巴管,侵润明显,分化很低。在临床术后生存率较低,预后较差。
5.3 结肠癌晚期扩散转移远端淋巴结及器官组织,其扩散特点:(1)大肠癌扩散:一般沿肠管横轴呈环状侵润,并向肠壁深层发展,沿纵轴上下扩散较慢,且累及肠段一般不超过10公分。癌侵及浆膜后,常与周围组织、邻近脏器及腹膜粘连。(2)淋巴转移:淋巴转移一般依下列顺序由近而远扩散,但也有不依顺序的跨越转移。①结肠淋巴结:位肠壁脂肪垂内。②结肠旁淋巴结 位邻近结肠壁的系膜内。③系膜血管淋巴结:位结肠系膜中部的血管旁,也叫中间淋巴结组。④系膜根部淋巴结:位结肠系膜根部。癌肿侵入肠壁肌层后淋巴转移的机率增多,如浆膜下淋巴管受侵,则淋巴转移机会更大。(3)血行转移:一般癌细胞或癌栓子沿门静脉系统先达肝脏,后到肺、脑、骨等其它组织脏器。血行转移一般是癌肿侵犯至毛细血管小静脉内,但也有由于体检时按压瘤块、手术时挤压瘤体所致,甚至梗阻时的强烈蠕动皆可促使癌细胞进入血行。(4)侵润与种植:癌肿可直接侵润周围组织与脏器。癌细胞脱落在肠腔内,可种植到别处粘膜上,脱落在腹腔内,可种植在腹膜上,转移灶呈结节状或粟粒状,白色或灰白色,质硬。播散全腹腔者,可引起癌性腹膜炎,出现腹水等。
5.4 根据结肠的临床分期或组织学分型,早期患者常采用内服以用奥沙利铂、氟尿嘧啶为主的保守治疗方案。效果较好。但在中晚期,治疗常以手术为主,改用根治性手术切除,切除范围除癌肿所在肠袢外及其肠系膜和区淋巴结。术后生存期较短,而且术后生活质量明显下降,如排泄功能下降,心理障碍增加、社交活动减少等等。因此术后辅助治疗是患者康复及生存质量改善的重要途径。
5.5本文36例患者在术后辅助治疗实验过程中,对患者进行临床学意义分析,除绝对与家族遗传病及相关曾病史关联外,还与患者的饮食(常吃红肉等)、生活习惯(如饮酒、便秘等)及缺乏维生素D3和钙质类的食物等密切相关。维生素D3作用于结肠癌的作用已经在上一部分详细的阐述过,简而言之为维生素D3作用于TGF-β调控Runx3因子表达于结肠癌细胞,使癌细胞增长得到抑制及凋亡。在术后的维生素D3组辅导治疗中的血清肿瘤标志物(CEA和CA19-9)比对照组恢复较快。并且在复检便潜血、腹部CT和身体各项康复指数如睡眠、气色、活动、康复时间、康复人数等都要明显优于对照组(P>0.05)。
5.6 在结肠癌保护因素中,维生素D3由于与许多肿瘤和疾病相关成为了目前研究的一个热点。大量的回顾性研究倾向于认为维生素 D3对大肠癌有保护作用,但也有临床的 RCT 研究得出了阴性结果,因此现阶段维生素 D3与大肠癌的关系尚存在争议。根据目前的各类研究结果,倾向于认为维生素D3对大肠癌有保护作用,但要明确维生素D3 与大肠癌之间的关系还有待进一步明确其作用机制。
5.7结肠癌治疗
结肠癌的中晚期治疗主要以手术为主,辅以放、化疗辅助治疗,其主要死亡原因在于肿瘤的复发及转移。近年研究发现,肿瘤的生长主要依赖于血管的增殖,随着分子生物学技术的发展,通过抑制血管生成从而达到抗肿瘤的基因治疗成为可能。对于目前结直肠癌这一恶性肿瘤以及相关的恶性肿瘤都没有办法进行合理的预期。Dukes分型Ⅲ期结肠癌中,手术可以治愈40%-50%的患者,但约有35%的患者术后尽管使用化疗仍会复发。对于Ⅳ期即存在远处转移的结肠癌,患者往往接受氟尿嘧啶(5-FU)、铂类药物或靶向药物的治疗,但目前并不能预测哪些患者对这些费用昂贵的药物有效。仅有西妥昔单抗能够通过Kras基因测定来预测。因此,考虑到辅助化疗的不良反应、治疗费用和对患者生活质量的影响,研究化疗的获益预测指标有显著的社会和经济效益。所以说对于不同的结直肠癌患者,根据结直肠癌的具体情况选择恰当的治疗手段,制定合适患者的个体化治疗策略,已经成为当今结直肠癌诊疗的主要发展方向,符合个性化医学的理念。适合个人的情况进行治疗,避免由于疾病造成患者及患者家属的心理的生理上的双重打击。在结直肠癌疗效预测方面,尤其是Ⅱ结肠癌中证据较为充分的一个分子标记物是微卫星不稳定(MSI)。DNA微卫星是短核苷酸的重复序列,在人类基因组中含量丰富。微卫星不正常的缩短或延长会导致MSI,从而引起癌变,这常常是由于错配修复基因(包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)的功能缺陷而导致。错配修复基因的缺陷见于80%的Lynch综合征,也有15%-20%的散发性结肠癌患者有此突变。正常情况下,错配修复系统可以识别DNA与5-FU结合而产生的复合物,从而激活细胞凋亡的级联放大,缺陷的错配修复则失去这一功能从而产生MSI。在PETACC-3研究中已经对MSI有了较为具有说服力的研究数据:微卫星高度不稳定(MSI-H)的Ⅱ期和Ⅲ结肠癌患者,其无病生存率及总体生存率较微卫星稳定(MSS)及微卫星低度不稳定(MSI-L)为好。这种预后的差距在Ⅱ期结肠癌中尤其明显。总的来说,临床上MSI的患者常常分期较早、预后较好,多见于右半结肠,对5-FU化疗反应较差。
随着实验技术的发展,目前高通量分析已广泛应用于肿瘤的研究。全基因组关联分析、单核苷酸多态性(SNP)等技术的成本越来越低。事实上,这些研究最终产生的实际临床经济学效益也将远远大于这些研究的成本。相应的统计学理论和统计软件也应运而生,用于处理这些实验技术所产生的巨大信息量,分析其与肿瘤患者预后的相关性,并作出化疗有效性及预后的判断。在临床试验中,前瞻性地验证实验结果难度相当大,这方面已有了一些指南的帮助。预防结直肠癌的重要方法是消除已知的可能发生癌的因素。他强调,要保持健康的饮食习惯:应多吃山芋、玉米、水果、新鲜蔬菜等含有丰富的碳水化合物及粗纤维的食物,这些食物在肠道停留时间短,利于肠道毒素的排除。尽量少吃油炸、熏制、高脂肪、高蛋白的食物,不吃有可能腐败的水果、蔬菜及食物。保持健康的生活方式:适当增加运动量,保持规律的生活节奏,戒烟戒酒,控制体重。积极治疗已患的大肠疾病如溃疡性结肠炎、肠腺瘤等。如有结直肠癌的高危因素存在,如家族性结肠癌或息肉病、溃疡性结肠炎,应定期去医院咨询或检查,以便掌握自己的身体状况。便血往往是结直肠癌患者的第一个症状,其次是大便习惯改变,包括大便时间、次数的改变,以及便秘或不明原因的腹泻。直肠癌的患者大便次数会增多,但每次排便不多,有时只是排出一些黏液、血液,且有排便不尽的感觉。部分患者可在便秘后出现腹泻,或者大便开始时干燥而末端变稀,或便秘与腹泻反复交替出现。部分病人是以腹泻为首发症状,每日排便次数增多,可为黏液血便、黏液浓血便为溏薄的稀便,可伴有内急后加重感,此时应与细菌性痢疾加以区别。约有50%的直肠癌患者排便时有疼痛感,程度有轻有重。部分病人以腹部隐痛为首发或突出的症状。也有病人表现为典型的不完全性肠梗阻性腹痛,即疼痛为阵发性绞痛,并伴有腹胀、乏力、贫血等。
由于结直肠癌发病机制的多样性和复杂性,单一的肿瘤标志物很难准备的对结直肠癌变程度分期以及预后影响进行判断。许多相关研究表明:对结直肠癌中的TGF-β1指标进行联合检测对结直肠癌的评定及预后影响具显著相关。当前临床对结结直肠癌的治疗仅仅只局限于肿瘤切除术,肿瘤血管的生成受多种细胞因子的正负综合调控,TGF-β1的表达在细胞自身增殖,分化,生长的过程中均起着重要的调控作用。其中TGF-β1是一种具有多肽链结构,可以对肿瘤细胞的生长分化扩散以及浸润起到双重调节作用。在癌变细胞开始增殖生长的前期,TGF-β1调节因子能够起到抑制作用,但是当癌变细胞数量和体积长到一定程度,就会脱离TGF-β1调节因子的调控,开始难以控制的扩散。同时TGF-β1调节因子还会促进癌变血管生长,从而为癌变细胞的生长,增殖,分化,浸润以及扩散起到促进作用。因此TGF-β1在癌变细胞生长的过程中起着重要的作用。Akt也在结直肠癌的癌变细胞生长,增殖,分化,以及扩散转移中起着重要的促进作用,有相关研究表明:Akt是细胞进行分化生长的最紧密关联通道之一,其通道的活化程度直接关系着对细胞凋亡的抑制,以及细胞扩散的促进,由此可见Akt通道在癌变肿瘤的扩散增大中起着关键的作用,有相关研究证实:结直肠癌癌变组织的Akt表达数量要远远高于正常直肠组织。mTOR(雷帕霉素IE蛋白)对人体蛋白质的合成具有重要的调控作用,其主要分为雷帕霉素IE蛋白C1和雷帕霉素IE蛋白C2两类。mTOR主要通过介导细胞生长中的氧气养料的提供对细胞的分化生长增强起到调控作用,另外,mTOR对细胞的分裂也有较强的介导作用。相关研究证实:在结直肠癌的患者癌变组织中mTOR通路的活性显著高于正常的直肠组织,由此我们可以推断,mTOR能够促进癌变细胞的分裂,生长,增殖,分化,浸润以及扩散,在直肠组织癌变的过程中起到关键的促进作用。综上,我们可以推测TGF-β1在结直肠癌中起着关键的研究价值。
Ku等研究发现32种结直肠癌细胞系和87例癌组织中Runx3基因的突变、杂合性缺失和启动子甲基化状态,发现有l6种癌细胞系存在Runx3基因表达缺失或下调,其中75%(12/16)存在启动子的高甲基化。在87例癌组织中有l6例(18.4%)检测到Runx3基因的甲基化,而在相应的正常组织均未发现RUNX3基因的甲基化。此外,有研究报道Runx3在癌组织中表达明显降低,且在低分化和伴有淋巴结转移组中低于中高分化和未转移组;在正常黏膜组织中未检测出Runx3基因启动子的甲基化,而在大肠癌组织中有53.75%检测到甲基化存在。上述研究表明Runx3与人类结直肠癌的发生发展有密切相关,且与肿瘤的分化程度和转移相关。因此,Runx3可能为结肠癌的临床诊治甚至预后评估提供一个非常有价值的参考指标。
目前认为Runx3的抑癌机制与具有生长抑制和凋亡诱导因子功能的TGF-β通路密切相关,Runx3是TGF-β信号通路下游的一个转录因子,Runx3蛋白与DNA结合,在TGF-β/BMP信号传导中起重要作用。研究表明,Smad复合物须在Runx3等Runx蛋白的协助下才能从细胞质进入细胞核特定的靶位点,而Runx3蛋白也需要在TGF-β的协助下才能由细胞质进入细胞核,从而对细胞的分化、周期调控、凋亡和恶性转化起作用。。Runx3  蛋白在靶基因启动子区可与众多转录因子相互作用,从而增强或主动抑制靶基因的转录激活;对于转录沉默而言,Runx3蛋白可募集转录辅助抑制因子如Sin3A或TLE蛋白家族成员,后者与羧基末端VWRPY五肽基序相互作用。因此,Runx3转录因子与TGF-β超家族成员共同介导一些重要的生物学效应。当Runx基因表达受抑制时,影响TGF-β信号通路的转导,从而诱导肿瘤的发生。
TGF-β可以激活周期素依赖激酶p21、p15和p27的表达,抑制细胞周期的进展。Chi等研究显示Runx3通过调节p21的活性影响细胞的生长周期,具体为Runx3是p21基因的下游调控子,p21在细胞生长周期中具有重要作用,其通过抑制周期素依赖性蛋白激酶表达而使细胞周期停滞与G1期。P21启动子包括5个与Runx结合位点,即3个完全匹配的a、b、c位点和2个部分匹配的d、e位点,当Runx3结合域突变时,p21启动子的活性明显降低,而Runx3和Smad3协同表达时p21启动子被激活,激活的p21通过抑制CDKs表达而使细胞周期停滞于G1期。Runx3的抑癌活性与其诱导p21表达的能力相关。因此,Runx3的抑癌作用可能部分由于Runx3参与TGF-β信号转导,激活p21蛋白的表达。P53也是通过调控p21表达活性来调节细胞生长周期,两者作用机制类似,但作用的信号通路不同。也有研究报道Runx3对细胞增殖和凋亡的作用,恢复Runx3表达可导致cyclin D表达下调,但可以上调p27和caspase 3、7和8的表达,这可能是Runx3诱导调亡的机制。目前已知的Runx3靶基因有防御素NP-3和MDRl等,但具体的调控机制尚不完全清楚。
TGF-β1是一种多肽链结构的细胞调控因子,是由两个结构相同或相近的、分子量的12.5kDa亚单位借二硫键连接的双体,定位于染色体19q3,属于一组新发现的调节细胞分化和生长的因子,其必须与受体结合才能起到调控作用。国内外研究表明,非活性状态的TGF-β1是可有机体多种细胞分泌而得,通过酸化,可在一时间被活化。且蛋白的自身裂解作用可使复合TGF-β1变为活性TGF-β1。在人血小板和哺乳动物的骨骼中,TGF-β1的含量是最高的。研究表明:TGF-β1与其受体主要通过对smads的信号通路进行介导而发挥调控作用,但具体的作用机制尚不清晰。近年来有大量研究表明:TGF-β1在宫颈癌,结直肠癌,膀胱癌,前列腺癌以及乳腺癌等多种癌变组织中的表达阳性率均高于正常非癌变的组织。相关研究表明:TGF-β1对癌变细胞的调控作用具有双重性,即在癌变细胞癌变早期,TGF-β1会抑制癌变细胞进一步分裂,增殖,生长,扩散等,但是当癌变细胞长到一定的体积和数量能够脱离TGF-β1调控因子的控制,从而开始无限制的复制,增殖,生长,扩散,并且此时的TGF-β1调控因子能够刺激癌变血管的生长,当血管介入到癌变的组织细胞中此时,会为癌变细胞提供足够的养料,氧气,为癌变细胞的进一步扩散,增殖生长,以及浸润,转移提供了优越的条件,由此可见TGF-β1调控因子与结直肠癌的产生有着显著的相关性。故本文通过研究其具体的表达及意义,为今后临床提供数据支持和理论依据。
参考文献(略)