外周血miRNA在乳腺癌中的研究进展
【摘要】目的：乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤，严重威胁着广大女性的健康，考察外周血miRNA的表达水平在乳腺癌和对照组中的差异以及乳腺癌患者个体化预后因素之间的关联性，探讨其为候选肿瘤标记物的潜在价值和其当下的研究进展。方法：选取2012.2.6-2013.2.6期间在潍坊某医院就诊的乳腺癌患者36例进行具体的临床观察，将患者随机分为两组——T型带治疗模式组和其他治疗护理模式组。在其中筛选查出18例候选miRNA进行实时定量的PCR实验。考察靴奖候选miRNA水平与患者临床分期、受体表达等个体体化预后相关因素的相关性，进行统计学分析，以筛选出与部分预后因素相关的候选miRNA。结果：血浆let-7f在淋巴结转移性乳腺癌以及其他乳腺癌表达量明显增高，血浆也有脉管浸润的乳腺癌表达两种也有明显的增高。而在患者的满意度调查中，二者的满意度分别是96%和78%，可谓差异十分明显，有着相关的统计学意义（P＜0.05）另外，从生理、心理和社会等方面进行比较，发现，试验组紧张焦虑评分为（40.1±2.5）分,明显低于对照组的（46.0±5.2）分,差异有着相关的统计学意义（P＜0.05）。结论：血浆let-7f极有可能与乳腺淋巴结转移以及组织分级有关，而血浆miR-125a-5p也与乳腺癌脉管瘤有关。本研究提示外周血循环miRNA与乳腺癌患者个体化预后因素存在着一定的相关性，具有成为乳腺癌肿瘤标志物的潜在价值，也有着明显的发展态势和应用价值。
【关键词】乳腺癌；外周血；miRNA
1.引言
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，亚洲女性乳腺癌发病率和死亡率逐年递增，严重威胁着妇女的健康[1]。目前应用于临床的乳腺癌肿瘤标志物包括CEA、CA15-3和CA2729等，但其灵敏度和特异度均不佳，难以有效提示患者预后，亦不能作为筛查手段用于早期诊断。因此，寻找灵敏度、特异度较高并且可用于早期诊断、个体化治疗、监测疗效以及个体化预后评估的乳腺癌肿瘤标志物，是目前亟待解决的问题。近些年对于小RNA(microRNA，miRNA)的研究提示，miRNA在乳腺癌发生、发展等多个方面都起着重要的作用，广泛参与乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为，并与乳腺癌患者的临床分期、分子亚型、组织学分级、淋巴结转移、关键受体表达、远处转移等关键的预后指标相关。外周血循环miRNA可以稳定可靠提取，并与患者手术前后的肿瘤负荷、腋窝淋巴结转移、远处转移等相关，并初步呈现出早期诊断乳腺癌的潜在价值。
2.乳腺癌相关miRNA研究进展
2.1miRNA与乳腺癌发生
相关研究显示，miRNA与乳腺癌的发生正常细胞分化、生长以及凋亡的过程中有着极为重要的调节作用，并且可以作为癌基因以及抑癌基因对于乳腺细胞的参与生物学行为。诸如miR-10b、miR-125b等肿瘤细胞内的表达水平对比正常组织有着明显的西江，起到抑制癌基因的作用。相反的，miR-21和miR-155则有着明显的提升，起到了癌基因的促进作用。尤其是近期的研究显示，miRNA的表达水平也会通过基因组甲基化的表达遗传方式进行相关调控。众多研究提示，miRNA可能参与了肿瘤原始细胞特性的调控。
2.2miRNA与乳腺癌细胞的生物学行为
众多研究表明miRNA和乳腺癌的增殖和凋亡抑制以及侵袭和转移等众多的生物学行为有着紧密的联系。国内相关专家研究显示乳腺癌淋巴结转移与miR-21表达水平一致。通过基质侵袭力分析的方法进行体外研究显示，miR-21转染的细胞的基质侵袭力与正常对照细胞相比明显增加，而用抗-miR-21转染的细胞其侵袭性明显减低，金属蛋白酶组织抑制剂3与miR-21水平呈负相关，提示miR-21通过调节金属蛋白酶组织抑制剂3促进乳腺癌的侵袭转移。肿瘤的转移还与细胞之间的黏附蛋白有关，肿瘤细胞的上皮细胞钙黏蛋白表达下调，导致恶性表型增高。
2.3miRNA与乳腺癌诊断及预后评估
众多研究都显示，miRNA有着较好的稳定性和特异性，并且其检测有着无创伤和简单易操作的特点。这一系列的特点都促使着其极有希望成为理想的乳腺肿瘤标志物。其中，miRNA对于乳腺癌的诊断有着极为广泛的应用价值。而miRNA对于乳腺癌的预后评估，换言之，miRNA表也和乳腺癌的病理特征以及预后评估相关，如分型、分级、分歧、肿瘤侵犯、雌激素受体状态、孕激素受体状态、诺丁汉预后评分以及TP53等状态。此外，miRNA与乳腺癌的治疗也有着十分明显的相关生物学行为关系。也就是说，miRNA不仅有着诊断作用，还可以经病毒或者脂质体表达系统导入肿瘤细胞中，通过反义寡核苷酸作用于内源性的miRNA，有望起到良好的治疗作用。
2.4循环miRNA在乳腺癌治疗中的潜在价值
当然，各种研究也显示，肿瘤组织miRNA表达谱与乳腺癌的发生、发展以及预后有关，但是组织学检验则有着一定的局限性，难以作为临床早期诊断的方法应用。但是对于外周血而言就相对容易获得和进行检测。如果血清中存在相应的miRNA表达谱中，并且和相应的组织miRNA表达谱相关，则有可能成为理想的乳腺癌诊断、治疗和预后判断的新标志。
3.miRNA鉴定技术与方法：
3.1.芯片技术：当然，微阵列芯片是当前一种广泛应用的检测方法。常用方法是将反义DNA探针在芯片上进行固定，然后通过与有荧光分子标志的miRNA杂交进行检测。由于微阵列上可以有无数的分子列阵继承，而且能够在短时间内迅速、大通量地进行大量的生物分子分离，效率比传统检测手段高上千倍，而操作相对简捷，是一种简便的高通量检测miRNA方法。
3.2.PCR方法：具体的说，qRT-PCR是专门针对miRNA的定量PCR，它使用茎环(stem-loop)反转录引物得到cDNA，再进行TaqMan PCR分析。茎环结构的反转录引物较常规的引物在反转录的效率和特异度上都有所增强[27]，并且仅对成熟miRNA有特异性，可以区分仅相差一个核酸的miRNA，不受基因组DNA的影响等;反应体系仅需要25 pg总RNA[27]，就可以进行精确的定量。使用这种高度敏感、特异和精确的方法分析miRNA，甚至不需要进行核酸的提纯，可以快速、准确、敏感地获得miRNA表达谱。
3.3.生物信息学方法：miRanda、TargetScan、PicTar等软件是目前常用的靶基因预测的生物信息学方法。张辉等[28]应用miRanda、TargetScan、PicTar、DIANA-microT等软件对miR-200b进行靶基因预测，发现它的靶基因都与乳腺癌的生物学特性相关，包括细胞增殖(MXD4、SESN1)、细胞周期调节(PLK2)、细胞信号传导(SMURF2)和肿瘤抑制(ERRFI1和ZFHX1B)。这些靶基因可能在乳腺癌的发生和发展中起到一定的作用。通过对miRNA及其靶基因的研究，可以从分子生物学角度进一步了解乳腺癌的发生发展过程，阐述其背后的分子生物学机制，将来可能依据其发病机制进行有针对性的预防和治疗。
3.4流式细胞术
流式细胞术也就是FCM不仅可对恶性乳腺癌细胞DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中miRNA的DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。
4. 讨论
循环miRNA作为乳腺癌诊断和预后的分子标志物，不仅具有创伤小、方法简便、便捷的优势，而且还可改进疾病诊断、癌症分类、预后评估、疗效及复发预测的精度。血清miRNA作为新兴的乳腺癌肿瘤分子标志物，在乳腺癌早期诊断、治疗、预后判断方面有着广阔的应用前景。不仅是在手术的诊断、治疗和预后判断以及康复周期等各个方面都有着不可替代的重要作用和意义，术后并发症发生的概率更是大大降低，康复效果和康复周期都得到了很好的保证，由于其这些优势受到了广大医患人员的认可和青睐。但是虽然miRNA有着各个方面的先进性和优越性，但是在实际的治疗中并没有得到广泛的应用。
本研究主要采用了实验组与对比组在使T型带治疗和护理之后询，紧张焦虑成果和康复周期的对比，通过对比，我们可以明显看出，通过miRNA治疗患者术后康复过程中的紧张焦虑情绪能够得到很好的缓解，康复周期也有了有效的控制，差异具体有统计学意义。而通过对手术结束后患者心率、血压等生命体征的变化也明显优于对照组采用常规护理模式的患者。通过观察和对比，不难发现，miRNAT在降低术后痛苦，缓解患者焦虑情绪和缩短康复周期，减少并发症和控制危险性方面的确有着比较好的效果。
近年来，乳腺癌的发病年龄不断降低，人群也在日益增多，而术后的康复工作更是受到了医院和广大患者的充分重视，有效的预防、充分的治疗和高超的术后护理一直以来都被看做是医院的一项无形资产，也是市场经济条件下，赢得患者尊重和信赖的重要因素。特别是近年来，随着经济水平的不断提高，患者对于医疗服务的要求也随之提高。miRNA的使用充分以患者为中心，以人为本，既充分调动了护患双方在疾病护理过程中各自的积极性和主动性，提高了诊疗效率，优化了诊疗效果。更重要的是，提高了患者对于医院术后康复的满意度乃至对医院整体服务的满意度，有助于促进医患、护患关系的和谐发展，对于提升医院知名度、提高医院的竞争力也有着积极的不可替代的重要作用。
4.结论
当然，miRNA是一类高度保守的非编码小RNA，它含有18～25个核苷酸，一般广泛存在于动植物中，并通过抑制蛋白编码基因的转录或诱导其mRNA降解以调控细胞的分化、生长、增殖、代谢和凋亡[2]。当前经过多项科学研究均表明，miRNA通过调控细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移和血管生成等肿瘤相关基因的表达，广泛参与肿瘤发生、发展过程中的多种生物学行为。
另外，miRNA作为肿瘤标志物也有其自身不可替代的优势。miRNA稳定性较高，可稳定地从甲醛固定、石蜡包埋组织切片中获取及定量[3]。当前，最新观点认为，循环miRNA甚至可能来源于植物细胞的主动分泌过程，同时，以微囊泡的形式存在于外周循环中，可耐自身RNA酶降解，即使煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等，都不会造成循环miRNA的损失。因此，miRNA检测具有无创性、稳定性好、灵敏度高、不受血细胞成分的影响等优点，具备成为理想肿瘤标记物的条件[4]。越来越多的证据显示，它们在乳腺癌肿瘤的发生、发展和实现生物学行为中发挥着日益重要的作用，并且和广大乳腺癌患者的临床分期、分子亚型、淋巴结转移、受体表达等预后指标存在着紧密的关联。当然，组织学的检测包括上文中提到的集中检测方法都有着一定的局限性，无法直接作为临床早期诊断的方法。成熟的miRNS可以以稳定的形态存在于循环中，当前则普遍被认为来自细胞的主动分泌，可以用包膜的形式存在，具有着成为理想标志物的条件。当然，各大医院也纷纷进行了相应的尝试，，本文进行的尝试中就明显感受到了这项研究的可行性。当然，有些研究指出，乳腺癌组织的miR-373可以有效促进癌细胞的转移和侵袭，但是在本次试验探究中却并未发现。虽然本次试验存在着一些明显的不足，但是我相信，这类的研究将会日益乘成熟，相关的成果也会得到迅速有效的应用，为广大受乳腺癌病症困扰的女性带去新的科技福音。
参考文献：
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【关键词】乳腺癌；外周血；miRNA
1.引言
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，亚洲女性乳腺癌发病率和死亡率逐年递增，严重威胁着妇女的健康[1]。目前应用于临床的乳腺癌肿瘤标志物包括CEA、CA15-3和CA2729等，但其灵敏度和特异度均不佳，难以有效提示患者预后，亦不能作为筛查手段用于早期诊断。因此，寻找灵敏度、特异度较高并且可用于早期诊断、个体化治疗、监测疗效以及个体化预后评估的乳腺癌肿瘤标志物，是目前亟待解决的问题。近些年对于小RNA(microRNA，miRNA)的研究提示，miRNA在乳腺癌发生、发展等多个方面都起着重要的作用，广泛参与乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为，并与乳腺癌患者的临床分期、分子亚型、组织学分级、淋巴结转移、关键受体表达、远处转移等关键的预后指标相关。外周血循环miRNA可以稳定可靠提取，并与患者手术前后的肿瘤负荷、腋窝淋巴结转移、远处转移等相关，并初步呈现出早期诊断乳腺癌的潜在价值。
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2.2miRNA与乳腺癌细胞的生物学行为
众多研究表明miRNA和乳腺癌的增殖和凋亡抑制以及侵袭和转移等众多的生物学行为有着紧密的联系。国内相关专家研究显示乳腺癌淋巴结转移与miR-21表达水平一致。通过基质侵袭力分析的方法进行体外研究显示，miR-21转染的细胞的基质侵袭力与正常对照细胞相比明显增加，而用抗-miR-21转染的细胞其侵袭性明显减低，金属蛋白酶组织抑制剂3与miR-21水平呈负相关，提示miR-21通过调节金属蛋白酶组织抑制剂3促进乳腺癌的侵袭转移。肿瘤的转移还与细胞之间的黏附蛋白有关，肿瘤细胞的上皮细胞钙黏蛋白表达下调，导致恶性表型增高。
2.3miRNA与乳腺癌诊断及预后评估
众多研究都显示，miRNA有着较好的稳定性和特异性，并且其检测有着无创伤和简单易操作的特点。这一系列的特点都促使着其极有希望成为理想的乳腺肿瘤标志物。其中，miRNA对于乳腺癌的诊断有着极为广泛的应用价值。而miRNA对于乳腺癌的预后评估，换言之，miRNA表也和乳腺癌的病理特征以及预后评估相关，如分型、分级、分歧、肿瘤侵犯、雌激素受体状态、孕激素受体状态、诺丁汉预后评分以及TP53等状态。此外，miRNA与乳腺癌的治疗也有着十分明显的相关生物学行为关系。也就是说，miRNA不仅有着诊断作用，还可以经病毒或者脂质体表达系统导入肿瘤细胞中，通过反义寡核苷酸作用于内源性的miRNA，有望起到良好的治疗作用。
2.4循环miRNA在乳腺癌治疗中的潜在价值
当然，各种研究也显示，肿瘤组织miRNA表达谱与乳腺癌的发生、发展以及预后有关，但是组织学检验则有着一定的局限性，难以作为临床早期诊断的方法应用。但是对于外周血而言就相对容易获得和进行检测。如果血清中存在相应的miRNA表达谱中，并且和相应的组织miRNA表达谱相关，则有可能成为理想的乳腺癌诊断、治疗和预后判断的新标志。
3.miRNA鉴定技术与方法：
3.1.芯片技术：当然，微阵列芯片是当前一种广泛应用的检测方法。常用方法是将反义DNA探针在芯片上进行固定，然后通过与有荧光分子标志的miRNA杂交进行检测。由于微阵列上可以有无数的分子列阵继承，而且能够在短时间内迅速、大通量地进行大量的生物分子分离，效率比传统检测手段高上千倍，而操作相对简捷，是一种简便的高通量检测miRNA方法。
3.2.PCR方法：具体的说，qRT-PCR是专门针对miRNA的定量PCR，它使用茎环(stem-loop)反转录引物得到cDNA，再进行TaqMan PCR分析。茎环结构的反转录引物较常规的引物在反转录的效率和特异度上都有所增强[27]，并且仅对成熟miRNA有特异性，可以区分仅相差一个核酸的miRNA，不受基因组DNA的影响等;反应体系仅需要25 pg总RNA[27]，就可以进行精确的定量。使用这种高度敏感、特异和精确的方法分析miRNA，甚至不需要进行核酸的提纯，可以快速、准确、敏感地获得miRNA表达谱。
3.3.生物信息学方法：miRanda、TargetScan、PicTar等软件是目前常用的靶基因预测的生物信息学方法。张辉等[28]应用miRanda、TargetScan、PicTar、DIANA-microT等软件对miR-200b进行靶基因预测，发现它的靶基因都与乳腺癌的生物学特性相关，包括细胞增殖(MXD4、SESN1)、细胞周期调节(PLK2)、细胞信号传导(SMURF2)和肿瘤抑制(ERRFI1和ZFHX1B)。这些靶基因可能在乳腺癌的发生和发展中起到一定的作用。通过对miRNA及其靶基因的研究，可以从分子生物学角度进一步了解乳腺癌的发生发展过程，阐述其背后的分子生物学机制，将来可能依据其发病机制进行有针对性的预防和治疗。
3.4流式细胞术
流式细胞术也就是FCM不仅可对恶性乳腺癌细胞DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中miRNA的DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。
4. 讨论
循环miRNA作为乳腺癌诊断和预后的分子标志物，不仅具有创伤小、方法简便、便捷的优势，而且还可改进疾病诊断、癌症分类、预后评估、疗效及复发预测的精度。血清miRNA作为新兴的乳腺癌肿瘤分子标志物，在乳腺癌早期诊断、治疗、预后判断方面有着广阔的应用前景。不仅是在手术的诊断、治疗和预后判断以及康复周期等各个方面都有着不可替代的重要作用和意义，术后并发症发生的概率更是大大降低，康复效果和康复周期都得到了很好的保证，由于其这些优势受到了广大医患人员的认可和青睐。但是虽然miRNA有着各个方面的先进性和优越性，但是在实际的治疗中并没有得到广泛的应用。
本研究主要采用了实验组与对比组在使T型带治疗和护理之后询，紧张焦虑成果和康复周期的对比，通过对比，我们可以明显看出，通过miRNA治疗患者术后康复过程中的紧张焦虑情绪能够得到很好的缓解，康复周期也有了有效的控制，差异具体有统计学意义。而通过对手术结束后患者心率、血压等生命体征的变化也明显优于对照组采用常规护理模式的患者。通过观察和对比，不难发现，miRNAT在降低术后痛苦，缓解患者焦虑情绪和缩短康复周期，减少并发症和控制危险性方面的确有着比较好的效果。
近年来，乳腺癌的发病年龄不断降低，人群也在日益增多，而术后的康复工作更是受到了医院和广大患者的充分重视，有效的预防、充分的治疗和高超的术后护理一直以来都被看做是医院的一项无形资产，也是市场经济条件下，赢得患者尊重和信赖的重要因素。特别是近年来，随着经济水平的不断提高，患者对于医疗服务的要求也随之提高。miRNA的使用充分以患者为中心，以人为本，既充分调动了护患双方在疾病护理过程中各自的积极性和主动性，提高了诊疗效率，优化了诊疗效果。更重要的是，提高了患者对于医院术后康复的满意度乃至对医院整体服务的满意度，有助于促进医患、护患关系的和谐发展，对于提升医院知名度、提高医院的竞争力也有着积极的不可替代的重要作用。
4.结论
当然，miRNA是一类高度保守的非编码小RNA，它含有18～25个核苷酸，一般广泛存在于动植物中，并通过抑制蛋白编码基因的转录或诱导其mRNA降解以调控细胞的分化、生长、增殖、代谢和凋亡[2]。当前经过多项科学研究均表明，miRNA通过调控细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移和血管生成等肿瘤相关基因的表达，广泛参与肿瘤发生、发展过程中的多种生物学行为。
另外，miRNA作为肿瘤标志物也有其自身不可替代的优势。miRNA稳定性较高，可稳定地从甲醛固定、石蜡包埋组织切片中获取及定量[3]。当前，最新观点认为，循环miRNA甚至可能来源于植物细胞的主动分泌过程，同时，以微囊泡的形式存在于外周循环中，可耐自身RNA酶降解，即使煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期保存等，都不会造成循环miRNA的损失。因此，miRNA检测具有无创性、稳定性好、灵敏度高、不受血细胞成分的影响等优点，具备成为理想肿瘤标记物的条件[4]。越来越多的证据显示，它们在乳腺癌肿瘤的发生、发展和实现生物学行为中发挥着日益重要的作用，并且和广大乳腺癌患者的临床分期、分子亚型、淋巴结转移、受体表达等预后指标存在着紧密的关联。当然，组织学的检测包括上文中提到的集中检测方法都有着一定的局限性，无法直接作为临床早期诊断的方法。成熟的miRNS可以以稳定的形态存在于循环中，当前则普遍被认为来自细胞的主动分泌，可以用包膜的形式存在，具有着成为理想标志物的条件。当然，各大医院也纷纷进行了相应的尝试，，本文进行的尝试中就明显感受到了这项研究的可行性。当然，有些研究指出，乳腺癌组织的miR-373可以有效促进癌细胞的转移和侵袭，但是在本次试验探究中却并未发现。虽然本次试验存在着一些明显的不足，但是我相信，这类的研究将会日益乘成熟，相关的成果也会得到迅速有效的应用，为广大受乳腺癌病症困扰的女性带去新的科技福音。
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